2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授与邹振副教授团队在《Nucleic Acids Research》（影响因子=167）上发表了题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”的研究论文。该文开发了一种基于CRISPR/Cas12a的新型单核苷酸变异(SNV)检测平台——HEPSD（高能量惩罚SNV检测平台）。该系统通过二元crRNA结构设计，激活Cas12a的切割活性，并利用非平衡杂交来调节和放大单核苷酸错配的信号。

HEPSD平台在极端GC含量环境下，对于难以检测的SNV（包括摆动突变）具有显著的区分能力，其在临床样本中的识别准确度达到了100%，与qPCR及二代测序（NGS）结果高度一致。这一有效性展示了HEPSD在临床分子诊断中的巨大潜力，其设计理念同样能够扩展至其他CRISPR系统。

研究背景

单核苷酸位点变异(SNVs)是常见的遗传变异，广泛与多种严重疾病（如癌症、单基因疾病及传染病）的发生相关。传统的SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标、ARMS-PCR等）无法有效识别难以检测的SNV，特别是在摆动碱基对和高GC含量区域的SNV检测上。

尽管CRISPR-Cas系统（如Cas12a）在核酸检测领域具有革命性意义，但其在crRNA介导识别过程中，难以保证对所有单碱基错配的高特异性。尽管通过优化Cas蛋白及设计crRNA等策略提升了Cas12a性能，对摆动碱基对及高GC含量区域的SNV检测依然存在挑战。

研究结果

1. RNA/DNA二元探针与热力学分析

二元探针(BPs)由两个杂交臂组成，即长臂和短臂，专门设计用于通过选择性杂交来区分SNVs。研究显示，BPs在更广泛和较低的温度范围内展现出更好的性能，而且BPs相较线性探针(LPs)具有更长时间的结合稳定性。系统评估还表明，BPs在常规37°C下维持最佳活性。

2. 非平衡杂交驱动的高能量SNV检测系统

基于BP辅助Cas12a系统的激活性能，研究人员进一步设计了二元CRISPR RNA（crRNA）结构，开发了HEPSD平台。分子动力学模拟及荧光各向异性分析显示，HEPSD在匹配目标中形成稳定的三元复合物，而在错配目标中则展现动态不稳定性，有效抑制Cas12a的激活。2-氨基嘌呤（2-AP）荧光实验证实，当出现错配时，HEPSD仅部分解旋DNA，避免了Cas12a的误激活。因此，与传统CRISPR/Cas12a系统相比，HEPSD通过非平衡杂交驱动机制显著提升了SNV识别的特异性。

3. HEPSD对难检测SNV的高效区分能力

在验证HEPSD的平台性能后，研究团队评估了其对SNV的检测能力。HEPSD能够高效区分传统方法难以检测的SNV，包括高GC含量区域的突变和摆动碱基对错配。在低GC（30%）和高GC（70%）背景下，HEPSD展现出优异的特异性，检测限低至0.01%突变等位基因频率（VAF）。实时荧光实验和凝胶电泳结果显示，HEPSD对完全匹配目标拥有高效的切割活性，而对错配目标几乎无活性。

4. HEPSD分析BRAFV600E和EGFRL858R突变

为了进一步评估HEPSD在临床相关癌症突变检测中的有效性，研究者选择BRAFV600E和EGFRL858R作为靶突变。在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R的临床样本中（包括组织和血浆），HEPSD的敏感性和特异性均达到了100%，且与定量PCR（qPCR）及下一代测序（NGS）的结果高度一致。在血浆样本中，结合阻断置换扩增（BDA）技术，HEPSD成功检测到了低丰度突变（VAF低至0.01%），效果优于传统qPCR方法。ROC曲线分析显示，HEPSD的AUC值为1.000，反映出其卓越的诊断准确性。

结论与展望

通过本研究，介绍了一种基于二元间隔物辅助的CRISPR/Cas12a平台（HEPSD）。该平台通过创新设计“二元crRNA架构”，利用非平衡杂交驱动调控，显著增强了对错配碱基的能量惩罚差异，实现了超高特异性识别。HEPSD在处理难以检测的SNV方面表现优异，如能够精准区分传统方法难以处理的错配类型（如摆动碱基），并在高达70%的GC含量区域保持优异性能。该平台的成功应用显示其在临床分子诊断中的巨大潜力，尤其是在癌症早诊及个性化治疗中，为未来的基因编辑研究提供了新的思路和工具。尊龙凯时将持续关注基因检测技术的发展，并致力于为生物医疗领域带来更多创新解决方案。

本研究中所有DNA和RNA寡核苷酸的合成与纯化均由河马生物提供。河马生物为您提供crRNA，tracrRNA，sgRNA，引物设计合成及修饰服务，包括2′-F，2′-OMe，2′-MOE，LNA，PS，C16等多种选择。

参考文献[1] Liu Q, Jiang Z, Li S, Li Y, Wan Y, Hu Z, Ma S, Zou Z, Yang R. Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants. Nucleic Acids Res. 2025 Apr 10;53(7):gkaf287. doi: 10.1093/nar/gkaf287.

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