一、实验准备

1. hPSC诱导分化肝类器官试剂盒（abs90127-1kit）产品组成：

培养阶段

• H01基础培养基：119798 mL -20℃，12个月
• H01-A补充剂A：200 uL -20℃，6个月
• H01-B补充剂B：2 uL -20℃，6个月
• H02基础培养基：2199 mL -20℃，12个月
• H02-C补充剂C：100 uL -20℃，6个月
• H03基础培养基：31941 mL -20℃，12个月
• H03-D补充剂D：59 mL -20℃，6个月
• Matrigel：5 mL -20℃，6个月

2. 辅助试剂：

• DMEM/F12，货号: abs956050，规格: 500 mL，存储条件: 2-8℃，有效期: 12个月
• PBS，货号: abs962500，规格: 500 mL，存储条件: 2-8℃或室温，有效期: 12个月
• Y-27632，货号: abs812864，规格: 410 mg，存储条件: -20℃，1年（干粉）
• 人多能干细胞消化液，货号: abs940910，规格: 100 mL，存储条件: -20℃，有效期: 2年
• Advance人多能干细胞培养基，货号: abs940410，规格: 100 mL，存储条件: -20℃，有效期: 2年
• 台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒，货号: abs500365，存储条件: 2-8℃，有效期: 12个月
• 类器官传代消化液，货号: abs952050，规格: 500 mL，存储条件: -20℃，保质期: 12个月

3. 实验耗材：

• 细胞培养板（标准透明6孔板），货号: abs70331，存储条件: 室温，保质期: 3年
• 细胞培养板（标准透明12孔板），货号: abs70341，存储条件: 室温，保质期: 3年
• 细胞培养板（标准透明24孔板），货号: abs70351，存储条件: 室温，保质期: 3年
• 15 mL离心管，货号: abs71191，存储条件: 室温，保质期: 3年
• 50 mL离心管，货号: abs71201，存储条件: 室温，保质期: 3年
• 10 mL一次性移液管，货号: abs70531，存储条件: 室温，保质期: 3年
• 200 uL吸头（盒装，无菌无酶），货号: abs70751，存储条件: 室温，保质期: 3年

二、诱导流程图

三、培养方法

1. hPSC分化为内胚层细胞（DE）

以6孔板2个孔为例：

• 准备DE分化培养基，取5938 mL基础培养基1与60 μL补充剂A和2 μL补充剂B混合。
• 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合，然后铺板备用。
• 当hiPSC细胞汇合度达到75%-85%时，吸去培养基，用室温PBS清洗。
• 加入1 mL的hESC/iPSCPassageSolution，转移至37℃、5%CO2培养箱中解离成单细胞。
• 对细胞进行计数并筛选存活细胞，重悬细胞于DE分化培养基中。
• 将细胞悬液转移到包被的孔中，使用DE分化培养基进行培养。
• 24小时后更换培养基，连续更换2天。
• 第3天可检测内胚层指标。

2. DE诱导分化为肝特化谱系细胞（HS）

以6孔板2个孔为例：

• 第3天，混合199 mL基础培养基2与100 μL补充剂C，制备HS培养基。
• 用PBS清洗细胞，然后加入HS培养基。
• 将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中，连续培养5天，每24小时更换一次培养基。
• 第8天可进行HS指标检测。

3. HS诱导分化为3D肝类器官

以24孔板6个孔为例：

• 在第8天，混合1941 mL基础培养基3与59 mL补充剂，制备3D肝类器官培养基。
• 清洗HS培养基，并用含10μM Y-27632的hESC/iPSCPassageSolution处理细胞。
• 计数细胞并重悬于冷基质胶中。
• 将细胞与基质胶混合后，接种到24孔板中，待胶凝固后进行长期培养。

4. 3D肝类器官传代：

• 解冻基质胶并用冷PBS溶解。
• 添加类器官传代消化液，静置解离成单细胞。
• 将细胞重悬在基质胶中，进行重新接种。
• 继续培养，每隔1天更换培养基，每周传代一次。
• 成熟后的肝类器官可进行染色鉴定或肝祖细胞检测。

在本实验中，采用尊龙凯时的产品将大大提高细胞培养与分化的效率，确保实验结果的可靠性和有效性。