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蛋白测序技术选择指南——尊龙凯时助你全面了解方法全景

发布时间:2025-07-31   信息来源:尊龙凯时官方编辑

在当今生命科学领域,蛋白质的一级结构,即其氨基酸序列,已不再被视为静态的分子代码。它不仅决定了蛋白质的空间构象和功能特性,更深刻影响细胞行为、信号通路的动态变化,甚至对进化路径和疾病机制产生显著影响。因此,获取蛋白质的准确序列成为深入理解其生物学功能和作用机制的基础。

蛋白测序技术选择指南——尊龙凯时助你全面了解方法全景

蛋白测序(Protein Sequencing)与传统的“蛋白鉴定”有所不同。蛋白测序专注于完整且连续的氨基酸信息,用于解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白的一致性或追踪翻译后修饰等重要科研任务。在生物制药、个体化医学、结构生物学和抗体工程等高精度领域,蛋白测序技术的精细化能力正日益成为关键技术杠杆。

蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学研究中,“测序”和“鉴定”这两个术语常常被交替使用,从而导致术语错误和技术选择失误。蛋白测序的定义是对蛋白质进行氨基酸序列解析的过程,旨在重建其一级结构的连续排列,通常以N端到C端的方向表达部分或全部氨基酸序列,其目标在于获取“序列本体”,而不单是判断蛋白的“存在性”或“类别归属”。

相比之下,蛋白鉴定(Protein Identification)依赖质谱与数据库的匹配,确定某肽段是否“属于”某已知蛋白,其为分类式的“归属判断”,而非逐位点的信息重建。

蛋白测序技术的发展

1. Edman降解:高精度线性识别的起点

Edman降解是20世纪50年代由Pehr Edman提出的首次化学实现蛋白质序列解析的方法。该方法基于苯异硫氰酸(PITC)对N端氨基酸的特异性反应,通过顺序性标记与切除,每轮释放并鉴定一个PTH-氨基酸,从而实现线性序列重建。尽管其优点在于单个氨基酸级别识别的高精度,但局限性在于仅适用于具有游离N端的纯化样品,序列长度通常不超过30-50个残基,且无法处理混合物或修饰蛋白。

2. Bottom-up质谱策略:高通量测序的技术中枢

引入质谱技术是蛋白测序发展中的关键转折点。Bottom-up策略将蛋白质通过特异性酶如胰蛋白酶酶解为短肽段,并通过LC-MS/MS对肽段进行检测,再利用数据库比对或denovo算法重建蛋白质序列。该策略具有良好的通量和适配性,成为当今最广泛应用的蛋白测序方法。同时,其具有一定的结构性限制,比如序列上下文信息缺失和修饰定位的依赖性等,尤其在处理高度异构蛋白时仍面临挑战。

3. Top-down质谱策略:整分子结构识别的进一步探索

Top-down测序策略略过酶解步骤,直接将完整蛋白质送入高分辨率质谱系统,通过高能碎裂解析其多级碎片离子,从而实现一级结构的整体分析。该方法能够提供精确的序列及修饰定位信息,尤其适用于蛋白质翻译后修饰的识别和生物药的质量属性评估。

4. 单分子蛋白测序技术的兴起

传统质谱测序策略依赖肽段碎裂与谱图重建,这一方法固然成熟,但因依赖片段信息,存在一定局限性。近年来,研究者们开始开发无需酶解和拼接、可直接读取氨基酸序列的单分子测序技术。比如,纳米孔测序和荧光法测序,这些技术均能在不破坏蛋白整体结构的前提下,实现对单个分子的逐残基识别。

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